蛋白marker發(fā)展史

蛋白分子量標準，常稱之為蛋白Marker。在免疫印跡（Western blot）試驗中，分子量Marker雖不起眼，但意義重大，是陽性對照，是大小的標準，是必須的。只有Marker無誤了，實驗結(jié)果才有說服力。除此之外，蛋白Marker還能夠提示電泳是否正常，轉(zhuǎn)移是否成功等信息。 
 

光陰似箭，日月如梭，不知不覺中蛋白Marker經(jīng)歷了普通Marker、預染Marker和曝光Marker三個發(fā)展階段。

1.0代產(chǎn)品：普通蛋白Marker
 

  普通蛋白Marker，或稱之為未染色蛋白分子量標準，也叫預混合（pre mixed）蛋白分子量Marker，是簡單，也是準確的一種。由于沒有附帶染料分子或者是標記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是早期判斷蛋白大小*產(chǎn)品。普通Marker多數(shù)都選用預混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。

  預混的Marker通常有一個或者幾個條帶加倍濃度作為區(qū)別，用于幫助判斷每個條帶的大小。在選擇上來說，當然是選擇其中少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的，越近越好。普通Marker不如預染Marker好用，因為電泳過程中*看不到，要和目標蛋白一起等到后染色才能見真容，無法對實驗過程起預示參照作用。*屬于“后知后覺”型的，當然還是比“不知不覺”不做對照的要好。按照條帶的分子量大小通常有三種：寬分子量蛋白Marker、高分子量蛋白Marker、低分子量蛋白Marker。
 

  從實驗總體考慮的，應該選范圍盡量寬，條帶分布比較均勻的，這樣你的蛋白無論在哪個區(qū)間都容易判斷，避免正好落在一段空白區(qū)的風險。不過，條帶越多，價格可能也會越貴。如果買的是大包裝，就應該考慮分裝。要考慮到反復凍融對蛋白的傷害，不能因為實驗虐我，我就虐蛋白吧。另外要知道，寬譜的Marker不一定每條都能看到的，特別是Mini Cell。還有，如果側(cè)重大蛋白，那小的可能就已經(jīng)跑掉了，跟質(zhì)量無關(guān)。
 

  在一般的蛋白電泳當中，低分子量Marker（PR1400）使用較多，除了有指示蛋白大小的作用以外，有時還可以用作粗略的定量。還有一類特別小的蛋白Marker，比如用于30kD以下蛋白或者多肽的。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白Marker挺不錯，另外提醒一句，特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色漂亮，上樣量一定要足夠。 

2.0代產(chǎn)品：預染蛋白Marker
 

  預染蛋白分子量（prestained Marker），也叫預染Marker，是將Marker的蛋白，通過與染料共價耦聯(lián)，在電泳過程中或者轉(zhuǎn)膜時可以肉眼直接觀察到的一種蛋白分子量Marker。預染Marker帶來了很多方便，可以幫助我們在電泳時、電泳后，以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測電泳情況和估計遷移率。比如，已知垂直電泳較好分辨區(qū)域大約在膠的2/3處，如果使用預染Marker就可以預測目標蛋白進入分辨區(qū)時停止電泳以得到較好的分辨效果；如果觀察到Marker電泳異常也可以及時終止電泳。另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否*。

  Marker和染料一同轉(zhuǎn)移到膜上，可以方便的用來對照顯色后的目標蛋白大小。預染Marker有這么多優(yōu)點，所以現(xiàn)在應用的很多。值得注意的是，預染蛋白Marker與染料共價耦聯(lián)，在不同的緩沖條件下電泳時遷移特性可能會發(fā)生某些變化，可能會導致一些偏差，所以不太適合定位蛋白。如果拋開分子量的偏差，預染Marker還是很好用的，也可以和普通Marker一起使用，做對比。 預染Marker可以分為兩種：單色預染和多色預染（又稱為彩虹Marker）。單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的，觀察起來不是很方便。彩虹Marker（PR1910），比較容易區(qū)分條帶的大小。還有一點特別要注意，由于轉(zhuǎn)膜是一個將膠里的Marker轉(zhuǎn)印膜上，所以需要的上樣量相對少一些。如果想要在電泳過程中看到美麗的“彩虹”或者漂亮的單色Marker，往往需要比說明書里多加一些Marker的。省錢與美麗，背道而馳。

2.5代產(chǎn)品：間接曝光Marker

  普通Marker和預染Marker還有一個缺點就是不能夠在終Western曝光的膠片或者掃描照片中顯色，終判斷Western結(jié)果，還需要將照片和膜進行比對，容易出現(xiàn)偏差或者錯誤。很多產(chǎn)品在向終的顯色做努力，Biorad的Precision Plus Protein WesternC 就是其中的一例。該產(chǎn)品的所有條帶都含有 Strep-標簽，當使用 StrepTactin-HRP時可被化學發(fā)光檢測終顯示在凝膠轉(zhuǎn)印膜膠片或 CCD 圖像中。這個好像有些復雜，需要輔助另外的產(chǎn)品，或者多余的步驟，我們就把該類產(chǎn)品定義為蛋白Marker的第2.5代產(chǎn)品，或者叫做的蛋白Marker 2S吧（apple手機的命名規(guī)則）。

3.0代產(chǎn)品：曝光Marker

  說了這么多，大家也明白了蛋白Marker的第三代產(chǎn)品是什么樣子的。3.0版本的蛋白Marker，就是終的Marker條帶會和檢測目標蛋白會一同出現(xiàn)在顯色的圖片中，我們又稱之為曝光Marker（Exposure Marker）。曝光Marker的原理是，每個條帶蛋白都含有IgG結(jié)合位點，可以與人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊以及兔子來源的IgG恒定區(qū)結(jié)合，因此在實驗過程中這些蛋白可以直接或間接地結(jié)合二抗，與實驗樣品信號同時在X膠片上曝光顯色。由此可以更方便準確地判斷實驗樣品信號的位置和大小。
 

  曝光Marker克服了使用常規(guī)預染 Marker評估蛋白轉(zhuǎn)膜效率和樣品抗原信號時所存在的一些不足。

這些不足主要表現(xiàn)為：

1、預染marker經(jīng)過化學修飾后分子量與SDS-PAGE上表現(xiàn)的遷移率不一致；

2、預染marker無法在X光膠片上顯色，X光膠片上顯色的條帶需要與轉(zhuǎn)移到膜上的預染 Marker比對才能確認蛋白的位置和大小，整個過程比較繁瑣同時容易造成誤差甚是錯誤。

3、也是重要的一點，目的條帶和曝光Marker出現(xiàn)在同一圖片中，而不是后期的拼接，這樣的結(jié)果更讓別人信賴?，F(xiàn)在很多大文章都在使用曝光Marker，可以預見。