乙酰輔*A含量檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC0985

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入163μL試劑四，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

2、 試劑二：臨用前取1支先將液體甩離至管底，然后加入125μL試劑四，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

3、 試劑三：臨用前取1瓶試劑三B加入12mL試劑三A，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

4、 工作液：臨用前將試劑一、二和三按照1:1:90的比例混合，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：

乙酰輔*A廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔*A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔*A是合成脂肪酸、酮體、膽*醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD⁺生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔*A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔*A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應，乙酰輔*A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反應了乙酰輔*A含量的高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式低溫離心機、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：建議稱取約0.1g樣本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二進行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。

2. 細胞或細菌：建議取500萬細胞或細菌加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200w，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。

3. 血清（漿）或其他液體：直接檢測，若液體有渾濁則離心后測定。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 將工作液37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）預熱10min。

3. 取50μL樣本和205μL工作液至微量石英比色皿或96孔UV板，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和80s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

三、乙酰輔*A含量計算

A、使用微量石英比色皿測定

1. 按樣本質(zhì)量計算

乙酰輔*A含量（nmol/g 質(zhì)量）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V樣×V提÷W×F=819.9×ΔA÷W×F

2. 按照細胞數(shù)量計算

乙酰輔*A含量（nmol/10⁴ cell）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V樣×V提÷500×F=1.640×ΔA×F

3. 按液體體積計算

乙酰輔*A含量（nmol/mL）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V樣×F=819.9×ΔA×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；V反：反應總體積，2.55×10^-4L；V樣：加入樣本上清體積，0.05mL；V提：加入提取液一和提取液二的總體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌數(shù)量，500萬；F：稀釋倍數(shù)。

B、使用96孔UV板測定

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進行計算即可。

實驗實例：

1. 稱取0.1g兔腎加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二進行勻漿研磨，離心后取上清，稀釋2倍后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA= A2-A1=0.8083-0.7691=0.0392，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

乙酰輔*A含量（nmol/g 質(zhì)量）＝819.9×0.0392÷0.1×2=642.8 nmol/g 質(zhì)量。

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