檸檬酸合酶（CS）活
性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
貨號(hào): BC1060
規(guī)格: 25T/12S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入500 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑六：臨用前加入1.5 mL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔*A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸光值。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器、可調(diào)節(jié)移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL提取液和10μL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 將勻漿液600g，4℃離心5min。將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

3. 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS。

4. 在沉淀中加入200μL試劑一和2μL 試劑二，反復(fù)吹打充分混勻，用于CS測(cè)定，并用于蛋白濃度測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱10min左右（保證無(wú)沉淀）。

3. 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入

將上述試劑按順序加入1mL玻璃比色皿中，加試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄412nm波長(zhǎng)下10秒時(shí)的初始吸光度A1，之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2分鐘；迅速取出比色皿并擦干，412nm下記錄2分10秒時(shí)的吸光度A2，并計(jì)算測(cè)定管的ΔA1=A2-A1，對(duì)照管的ΔA1’=A2’-A1’，ΔA=ΔA1-ΔA1’。
三、CS活性計(jì)算
按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：37℃或25℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
CS（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷（Cpr×V樣本）÷T=1050×ΔA÷Cpr
ε：TNB的消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；d：比色皿光徑，1cm；V樣本：加入的樣本體積，0.035mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本的蛋白濃度，mg/mL。
注意事項(xiàng)：
1、測(cè)定過(guò)程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
5、附：使用樣本鮮重計(jì)算公式
單位的定義：37℃或25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
CS上清（U/g 質(zhì)量）=ΔA上清÷ε÷d×V反總÷（W×V樣本÷V提?。?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif">÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 質(zhì)量）=ΔA沉淀÷ε÷d×V反總÷（W×V樣本÷V樣總）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 質(zhì)量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清測(cè)定值；ΔA沉淀：沉淀測(cè)定值；ε：TNB的消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；d：比色皿光徑，1cm；V樣本：加入的樣本體積，0.035mL；V提取：提取液體積，1.01mL；V樣總：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；W：樣本質(zhì)量，g。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
取0.1g小鼠心臟樣本加入1mL提取液和10μL試劑二進(jìn)行勻漿研磨，取上清后再離心，取上清，取沉淀后加入200μL試劑一和2μL試劑二，之后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)吸光度后計(jì)算上清中：ΔA1= A2-A1=1.213-0.7=0.513，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.513；沉淀中：ΔA 1=A2-A1=0.447-0.133=0.314，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.314，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：
CS（U/g 質(zhì)量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
= 1061×0.513÷0.1+212×0.314÷0.1=6108.7U/g 質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

參考文獻(xiàn)：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0310/BC0315 輔酶Ⅰ NAD（H）含量檢測(cè)試劑盒
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