土壤酸性木聚糖酶（S-ACX）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5725

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 標準品稀釋液的配制：臨用前按緩沖液：試劑一= 4mL：2mL（6mL，約一條標曲稀釋用量）的比例進行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、 標準品：10mg木糖。臨用前加入667μL標準品稀釋液配制成100μmol/mL的木糖標準液，2-8℃保存8周。

產(chǎn)品說明：

土壤酸性木聚糖酶（Soil acid xylanase, S-ACX），又稱為土壤酸性半纖維素酶，主要分離自最適生長pH為4-5的微生物在酸性環(huán)境中，S-ACX催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進一步與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng)，在540nm處有特征吸收峰，反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，通過測定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率，可計算S-ACX活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽、30~50目篩、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

新鮮土樣自然風干或37℃烘箱風干，過30~50目篩。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、 標準品的稀釋：臨用前將標準品用標準品稀釋液稀釋為2、1.5、1.2、1、0.8、0.4、0.2μmol/mL的標準品待測。

3、 標準品稀釋表：

備注：實驗中每管需要150μL。

4、 樣本測定（在EP管中加入下列試劑）

三、S-ACX計算公式

1. 標準曲線的繪制：

根據(jù)標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 土壤S-ACX活性計算：

酶活定義：50℃，pH 4.8條件下，每克土壤每小時分解木聚糖產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量為一個酸性木聚糖酶的活性單位。

S-ACX活性（U/g 土樣）=x× V反總÷W÷T×F=0.15×x÷W×F

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2h；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 若樣本ΔA<0.01，可適當增大樣本量或者50℃反應(yīng)時間后測定；若樣本ΔA>1.5或者A測定＞1.5時，可用蒸餾水稀釋上清液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

2. 建議使用螺旋管，防止沸水浴過程中蓋子爆開，改變反應(yīng)體系。

實驗實例：

1、 取0.05g野蘑菇土樣，按操作表進行第一步反應(yīng)2h后，取上清液用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定- A對照=0.431-0.099=0.332，帶入標曲y=0.6582x-0.153 （R²=0.999），計算x=0.737，按樣本質(zhì)量計算S-ACX活性得：

S-ACX活性（U/g 土樣）=0.15×x÷W×F =4.422 U/g 土樣。

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