D-乳酸（D-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5350

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：  

1、 試劑二：臨用前取一支加入160μL蒸餾水溶解。2-8℃可以保存4周（該試劑為凍干試劑，可能存在肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實(shí)際質(zhì)量相同）；

2、 試劑二工作液的配制：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：90μL（1T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少；

3、 試劑三：臨用前加入15 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存4周；

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：1000μmol/mL D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取20μL 1000μmol/mL D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和1980μL蒸餾水混合配成10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液；再吸取20μL 10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液和620μL蒸餾水混合配成0.3125μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。D-乳酸在D-乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時(shí)使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據(jù)此可計(jì)算D-乳酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī)、1mL玻璃比色皿、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)

箱、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，波長調(diào)至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>EP管中）

三、D-乳酸含量的計(jì)算

1. 按照蛋白含量計(jì)算

D-LA含量（μmol/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）
= 0.3125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

D-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）

= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

=0.3711×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

D-LA含量（μmol/10⁶ cell）

= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）

= 0.3711×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

4. 按照液體體積計(jì)算

D-LA含量（μmol/mL）

=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]

=4.082×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.3125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項(xiàng)：

1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

2. ΔA測定的測定范圍在0.01-1.2之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.104g兔肌肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，使用比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.637-0.308=0.329，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.636-0.124=0.512，按照樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

D-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）= 0.3711×ΔA 測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =2.2929 μmol/g質(zhì)量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用比色皿測得計(jì)算ΔA測定管=A測定管-A對照管=0.356-0.302=0.054，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.636-0.124=0.512，按照液體體積計(jì)算含量得：

D-LA含量（μmol/mL）=4.082×ΔA 測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=0.4305 μmol/mL。

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