肌酐（Cr）含量檢測(cè)試劑盒說明書（肌氨酸氧化酶法）

可見分光光度法

貨號(hào)：BC4910

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前每支加入1.7 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

2. 試劑二：臨用前每支加入1.65 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

3. 試劑三：臨用前每支加入1 mL蒸餾水（50T/48S），充分溶解。為方便儲(chǔ)存故多給一支。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

4. 試劑三工作液：根據(jù)試驗(yàn)所需用量，按照試劑三：蒸餾水=1:9的比例，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5. 試劑四：臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩個(gè)月。

6. 試劑五：臨用前每瓶加入3.4 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

7. 試劑六：臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需用量，按照試劑六A液：試劑六B液=1:1的比例，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

8. 標(biāo)準(zhǔn)品：1 mg肌酐。臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解，即1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，2-8℃保存1個(gè)月。臨用前取50μL和200μL蒸餾水混合配制成200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

肌酐（creatinine，Cr），化學(xué)式是C₄H₇N₃O，是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，主要由腎小球濾過排出體外。血中肌酐來自外源性和內(nèi)源性兩種，外源性肌酐是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物；內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物。

肌酐在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安*比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505nm 有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、超聲破碎儀。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、細(xì)菌、細(xì)胞樣本的制備：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔9秒，總時(shí)間5 min）；于4℃，12000g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混勻，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測(cè)。

2、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混勻，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測(cè)。

3、血清（漿）：取100 μL血清（漿）加入1 mL提取液一，4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混勻，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酐含量計(jì)算

1、 計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

肌酐含量（μg/mg prot）= C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×V樣÷（V樣×Cpr）=200×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

肌酐含量（μg/g 質(zhì)量）= C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

肌酐含量（μg/10⁴ cell）= C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（細(xì)胞數(shù)量×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計(jì)算

肌酐含量（μg/mL）= C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×(V上清+V提取液二)÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]

= 2612.5×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，200 μg/mL；V樣：加入樣本體積，60 μL=0.06 mL；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8 mL；V提取液一：加入提取液一體積，1 mL；V提取液二：加入提取液二體積，0.15 mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以10⁴計(jì)；V液體：液體樣本體積，0.1 mL。

注意事項(xiàng)：

1、提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測(cè)定。若想要用蛋白濃度計(jì)算肌酐含量需要另取樣本，即取相同質(zhì)量的組織、同等數(shù)目的細(xì)菌或細(xì)胞，用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿；取相同體積的血清（漿），用1.206mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當(dāng)于提取步驟最終樣本上清液），用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

2、如果測(cè)定吸光值超過標(biāo)準(zhǔn)管吸光值，建議用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。如果ΔA測(cè)定小于0.01，建議增大樣本量后再進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g小鼠肌肉加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定-A空白=0.159-0.016=0.143，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.373-0.016=0.357。按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：肌酐含量（μg/g 質(zhì)量）=237.5×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷W=951.3 μg/g 質(zhì)量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定-A空白=0.095-0.079=0.079，ΔA標(biāo)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.373-0.016=0.357。按照液體體積計(jì)算含量得：肌酐含量（μg/mL）= 2612.5×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)=578 μg/mL血清。

肌酐含量檢測(cè)試劑盒 氮代謝 肌酐含量檢測(cè)試劑盒 氮代謝